分离软骨细胞提取人关节软骨RNA

2017-09-01   文章来源:Analytical Biochemistry   作者:​作 者:Shabana Amanda Ali, Benjamin Alman 翻 译: 冯琛 河北医科大学第三医院骨科研究所 点击量:16 我要说

作者报道了一种从人类关节软骨中提取RNA的优化方法,该方法不需要使用专门的设备或纯化柱,在减少降解、污染的同时最大限度地提高了RNA产量。该方法将软骨细胞从细胞外基质中分离,并将传统的Trizol提取方法改进为两轮RNA-DNA-蛋白相分离步骤。通过分光光度法、芯片分析系统、实时聚合酶链反应(PCR)对采用改进方法与传统的Trizol法提取得到的RNA进行了比较。结果表明采用改进的方法,从每100mg的软骨中提取RNA的回收率提高近1μg,并且RNA完整性数(RIN值)从2提高到7.5。

骨性关节炎(OA)是一种以关节软骨退化为特征的退行性疾病。对人类的关节软骨进行基因表达研究可以大大提高我们对OA的认知,但不断发展的基因组技术需要以足够量的高质量的RNA作为基础。从接受全膝关节置换手术的患者中取得的软骨组织样品为实验提供了相关生理学模型,但人体软骨的低细胞密度和高蛋白多糖含量严重影响了对RNA进行有效的高质量的分离。这是因为整个软骨中软骨细胞的含量仅为1%到2%,每克组织样品中的RNA含量是有限的,并且因为大部分的蛋白多糖和蛋白聚糖带负电荷,RNA的纯度因与蛋白质共纯化而受到影响。现有的从人类软骨中提取RNA的方法均未能解决这些特有的问题。其中一些方法需要专门的设备,如超微破碎仪和冷冻研磨仪,然而这些设备并不是在所有的实验室都会配备。这些方法通常会使用纯化柱对RNA进行提取或净化(例如Qiagen RNeasy纯化柱),但纯化柱的使用无疑会在提高质量的同时降低产率。鉴于软骨细胞中基因表达研究的价值,从软骨中分离RNA所固有的困难性,以及现有方法的局限性,作者研发了一种从人类关节软骨中提取RNA的优化方法。

经知情同意后,收取20例临床诊断患有骨性关节炎并进行全膝关节置换手术的患者关节软骨样本。关节软骨组织块被分成两组置于培养基中于37℃,5%CO2温箱中孵育过夜。向其中一组组织中加入Hedgehog(Hh)信号拮抗剂,另一组作为对照。文中所列RNA参数的相关数据取自对照组。为了进行比较,一些样品仍然按照传统的Trizol(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)方法进行RNA的提取。用液氮快速冻结样品,之后用研钵磨碎成粉末状,每50mg软骨组织粉末混悬于1mlTrizol试剂中,并用Polytron超声震荡仪混匀。按照产品说明的操作步骤提取RNA。并且选取一些样品用Qiagen RNeasy(Qiagen,Germantown,MD,USA)柱纯化。

在优化方法的第一部分,软骨细胞被从富含蛋白多糖的基质中分离出来。将每克软骨组织块置于10ml,0.25%胰蛋白酶中于37℃孵育45min,并用5mm玻璃微珠搅拌。向组织块中加入新鲜制备并经过过滤的胶原蛋白酶A1进行消化(3mg/ml胶原蛋白酶A1消化6小时或者1mg/ml胶原蛋白酶A1消化过夜)。试验组在消化期间还要向培养基中加入Hh拮抗剂来保证对基因表达的影响。被分离的细胞用TRIzol裂解后转移至含有1mm玻璃微珠的聚丙烯冻存管中,保存在-80℃,以待后用。优化的第二部分中,按照修改后的TRIzol操作步骤从软骨细胞中提取RNA。将组织用珠磨式组织研磨器Mini-Beadbeater (BioSpecProducts, Bartlesville, OK,USA)以4200rpm的速度匀浆30s。主要的优化在于RNA-DNA-蛋白质相分离的步骤。简而言之,含有RNA的水相被转移至一个新的离心管中,与传统TRIzol方法不同的是在沉淀RNA之前,还要加入等体积的TRIzol。冰上孵育30min后,残留的蛋白质和DNA通过相分离的方式被去除而并不影响RNA的产率。水相中的RNA继而被沉淀并重悬于不含核酸酶的水中。

以RNA完整性(未经降解)及RNA纯度(没有杂质)评估RNA的质量。用安捷伦2100生物分析仪测定RNA完整性数值(RIN),以检测RNA的降解。RIN值范围从0(代表质量最差或降解了的RNA)到10(代表质量最佳或完整的RNA)。完整性还可以通过观察电泳中18S和28S核糖体RNA(rRNA)条带进行鉴定。用NanoDrop1000分光光度计测定RNA的纯度和浓度。A260/280和A260/230比值偏低(<1.5)代表RNA中含有蛋白质、苯酚以及其他有机物杂质,相反,比值接近2.0则表示RNA的纯度相对较高。并且考虑到核酸在260nm处有最大吸收,蛋白质在280nm处有最大吸收,所以A260/280比值低表示存在蛋白污染。

在基因表达实验中,按照实验操作步骤用SuperscriptII(invitrogen)将RNA转录成互补DNA(cDNA)。为了验证RNA的质量对基因表达检测的影响,用TaqMan探针及COL2A1(hs00264051_m1)、COL10A1(hs00166657_m1)、MMP13(hs00233992_m1)和βACTIN(hs99999903_m1)引物进行实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time PCR)。为了明确Hh拮抗剂降低信号通路活性的有效性,对Hh靶基因GLI1(hs00171790_m1)和内参基因ASNS(hs00155888_m1)进行了检测。相对定量的数据方法分析数据。使用两样本的学生t检验进行统计学分析,假设方差不齐以alpha=0.05统计显著水平。

结果表明,优化的方法提高了从人类关节软骨中提取RNA的产率。按照优化方法第一步的操作将软骨细胞分离可以从每克软骨中得到平均1.1×106(±0.3×106,n=5)个细胞(台盼蓝拒染实验测定)。使用优化的方法可以从100mg软骨中得到1.1μg的RNA,而用传统的TRIzol加柱纯化的方法从相同量的软骨中仅可提取到0.2μg的RNA(图1A)。用这两种方法提取的RNA均显示出合理A260:280比值和低A260:230比值,但用优化的方法可以将A260:230比值从0.42显著提高到1.33(图1A)。同时,使用优化的方法还提高了RNA的完整性,使RIN值从2增加到7.5(图1A)。用传统的TRIzol方法提取RNA有降解,伴有低分子量污染与背景噪声(图1B)。用改良后的方法提取得到的RNA在电泳图上可显示出清晰的18S和28S rRNA峰值和条带,证明其为高质量RNA(图1C)。

为了评估RNA质量对基因表达分析的影响,具有代表性的软骨组织被分成两组,分别用优化方法和改良方法提取RNA。尽管用两种方法提取得到的RNA产率相当,但是用传统TRIzol法提取的RNA的A260:A280比值较低,反映出RNA中可能存在蛋白质污染(表1)。BCA检测显示经传统方法提取的RNA中每1ng含有0.36ng的蛋白质,而用优化方法提取的RNA中则检测不到蛋白质。实时荧光定量PCR结果表明用传统方法提取得到的RNA在检测COL2A1、COL10A1、MMP13、βACTIN等经常在软骨实验中检测的基因的转录情况时,总是需要更多的扩增循环次数(较高的CT值)(表1)。因为△CT值改变1个数值代表了基因表达量变化2倍,所以相应的△CT值的变化(表1)会最终导致在评估基因表达量中△△CT值的计算。

上述代表性软骨样本同时也被分成Hh拮抗剂处理组和未处理组。Hh拮抗剂处理组以用优化方法得到的RNA进行实时荧光定量PCR检测基因表达,Hh通路抑制由GLI1表达水平降低而证明,但是用传统方法提取的RNA经过40次扩增循环仍然无法检测到GLI1的表达。虽然这可以反映出GLI1的转录水平因为Hh信号通路的抑制作用而降低,但是该结果更说明了RNA的质量差,因为检测到内参基因ASNS的表达也需要大于35次扩增循环。因为标准偏差显示随着CT值的升高误差也会加大,所以在35~40个循环范围内的以CT值为基础的基因表达结果被认为是不准确的。这表明质量差的RNA将影响基因表达水平检测的精确性。

为了获得足够数量的高质量RNA用于基因表达分析,作者对从人类关节软骨中提取RNA的方法进行了优化。由于软骨细胞密度低和高蛋白多糖含量的特性,在提取RNA之前将软骨细胞从细胞基质中分离出来有几个优点:可以减少蛋白质污染,简化均质化过程,使样本尽量少的暴露于核酸酶中,以及增大RNA产量。去除蛋白质基质防止后续蛋白质与RNA发生共纯化有效的提高了RNA的纯度。均质化过程简化为在TRIzol中进行细胞裂解,可即刻保护RNA免于被RNA核酸酶降解,有效提高了RNA的完整性。最后,软骨细胞的分离可以使其集中而使每个样品制备RNA的产量最大化。基于这些改进,软骨细胞的分离是提高从人类软骨中提取RNA产率和质量的一种切实可行的改良策略。

然而这种方法也有其自身的缺点,将软骨细胞与其在体内的软骨基质分离可能会改变基因表达谱。因为在该研究中软骨细胞的微环境与RNA的质量这两个变量是依赖性改变的,所以并不能客观地确定软骨细胞的分离是否会引起基因表达的改变。Hayman和同事报道称进行6小时消化的软骨细胞与原生软骨相比,基因表达变化不多,这也是作者进行6小时消化的原因所在。因为文中并未说明样品RNA的质量,所以并不能确定他们观察到的基因表达的改变究竟是由于软骨细胞的分离还是RNA质量的不同而造成的。已有证据表明RNA的质量对基因表达检测如实时荧光定量PCR有独立影响。因为△CT值的变化会成倍的影响基因的表达,所以研究人员应该尽可能使用高质量的RNA进行基因表达的实验,并在发表文章时注明RNA的常规参数值。

该方法的优势还在于相较于体外实验中较长的细胞培养周期,该方法中用到的软骨组织块培养过程中细胞外基质被一直保留至RNA提取前才被消化,所以该模型可以被认为是一种更加接近OA病理的生理模型。为了在分离软骨细胞的同时维持对基因表达的影响,可向消化介质中加入药理调节剂或其他的基因表达效应物。因为软骨细胞的分离对基因表达变化的影响在实验组和对照组中是相当的,所以该因素并不对基因表达产生独立影响。对比实验组与对照组(如Hh拮抗剂处理组与未处理组)的差异则可以反映因为实验处理(如Hh通路抑制)而导致的基因表达差异。

研究组从全软骨中提取RNA,可以在使用传统的均质化的方法后,通过反复的RNA-DNA-蛋白相分离将蛋白质和DNA留在有机相而不减少水相中的RNA。Dell'accio和同事报道了一种依次用苯酚-氯仿-异戊醇的三相分离的方法,将孵育和离心时间延长至超过4小时。本文中提出的优化方法仅用TRIzol进行了两轮相分离,可在约2小时内完成提取。此外,Dell'accio和同事报道称其方法可以从每毫克成人关节软骨中得到5ngRNA。而用作者的优化方法,从每毫克相同软骨组织中则可以提取得到10ngRNA。

作者报道的从人类关节软骨中分离软骨细胞并提取RNA的方法使得高效提取高质量RNA成为可能。该方法可用于对同一关节的不同部位,以及人体不同部位的正常和病变软骨的基因表达进行研究。

图1 与传统TRIzol方法相比,优化的方法可以提高从人类关节软骨中提取的RNA的质量和数量。(A)RIN值和RNA的相关参数(粗体为均值,括号中为范围值)(*P<0.05)。(B和C)用传统TRIzol加Qiagen柱纯化方法提取的RNA代表性电泳图(B,RIN值2.3),用优化方法提取的RNA代表性电泳图(C,RIN值8.2)。峰值和标记的条带代表18S和28S rRNA。

表1 不同方法提取得到的RNA用于基因表达检测时得到不同的结果

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