目的 探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)源性成骨细胞(OB)及血管内皮细胞(VEC)复合同种异体冻干颗粒骨(AllogeneicFreeze-driedPartiallyBone,AFDPB)构建血管化组织工程骨移植修复大鼠桡骨节段性骨缺损中的成骨能力,为血管化组织工程骨临床应用提供实验依据。
    方法
    体外实验:4周龄SD大鼠,进行BMSCs原代细胞培养。取生长状态良好的第3代BMSCs诱导分化为OB和VEC。ALP染色,Ⅰ型胶原免疫细胞化学以鉴定成骨细胞;CD31,CD34免疫细胞化学染色以鉴定血管内皮细胞;MTT及扫描电镜检测成骨细胞、血管内皮细胞与AFDPB体外生物相容性及细胞毒性;流式细胞技术检测细胞与支架材料复合后细胞生长周期;5-溴脱氧尿嘧啶(Br dU)体外标记成骨细胞及血管内皮细胞,动物体内示踪两种细胞动力学。
    体内试验:8周龄SD大鼠36只,随机分为OB/ VEC/ AFDPB组(实验组)及AFDPB组(对照组)。每组16只。其余4只作为空白对照组。制备大鼠单侧桡骨中段5mm 节段性骨缺损模型,分别植入OB/ VEC/ AFDPB复合物及单纯AFDPB,并于2、4、8、12周4个时间点(每个时间点4只动物)处死动物立即于骨缺损部位取材,大体观察、组织学观察、免疫组织化学检测OPG、OPGL蛋白的表达,计算新生骨微血管密度(MVD),最终评估上述支架材料对骨缺损的修复作用。
    结果
    1.BMSCs诱导来源的成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)染色及Ⅰ型胶原免疫组化均呈阳性反应;血管内皮细胞表达其标志物CD31、CD34。
    2.MTT及扫描电镜检测成骨细胞及血管内皮细胞与AFDPB具有良好的细胞相容性,无细胞毒性。细胞在其表面及孔内平铺、伸展、生长及增殖状态良好。
    3.流式细胞仪检测AFDPB对OB及VEC细胞周期无影响。实验组细胞均为正常二倍体细胞,实验组与对照组比较无统计学意义(P>0.05)。
    4.成功制备出大鼠桡骨节段性骨缺损模型。各时间段大体形态与组织学观察:实验组骨缺损修复速度均明显优于对照组;BrdU 免疫组化染色显示:BrdU 体外标记成骨细胞及血管 内皮细胞复合AFDPB体内植入后2、4w,体内示踪仍可检测到两种细胞阳性表达BrdU;OPG 蛋白免疫组化结果显示:2、4、8w实验组OPG的表达高于对照组(P<0.05),而12w 时两组比较差异无统计学意义(P>0.05);OPGL蛋白免疫组化结果显示:2、4w实验组OPGL的表达高于对照组(P<0.05),而8、12w时两组比较差异无统计学意义(P>0.05);MVD计数结果显示:2、4、8w 实验组小血管数量多于对照组(P<0.05),12w时两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。
    结论
    1.BMSCs源性成骨细胞和血管内皮细胞可作为骨组织工程成骨和血管化种子细胞的理想来源。
    2.同种异体冻干颗粒骨抗原性低,无细胞毒性,有良好的细胞相容性,可作为组织工程骨较理想支架材料。
    3.将BrdU 标记的BMSCs源性成骨细胞和血管内皮细胞复合同种异体冻干颗粒骨植入骨缺损区,通过免疫组化检测,确定植入骨缺损区的部分成骨细胞和血管内皮细胞在体内成活并发挥作用。
    4.BMSCs源性成骨细胞和血管内皮细胞复合同种异体冻干颗粒骨作为组织工程骨移植物可以促进骨缺损部位骨形成和血管化,加快骨缺损愈合。