目的

    通过对比分析富血小板血浆(plateletrichplasma ,PRP)与血小板裂解液(plateletlysate ,PL)对体外培养的大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)生长增殖、细胞周期的影响,比较二者对促进大鼠骨髓基质干细胞生长增殖的生物学功效。

    方法

    1、4周龄SD大鼠,进行BMSCs原代细胞培养。取生长状态良好的第3代BMSCs进行实验。
    2、12周龄SD大鼠心内采血,梯度离得到PRP,3次反复冻融法制备PL。含10%胎牛血清的高糖DMEM 作为普通完全培养基组,分别加入血小板血浆和血小板裂解液至终浓度为1%和3%作为条件培养基组培养BMSCs。CD44、CD34鉴定BMSCs;倒置相差显微镜、MTT法检测BMSCs的增殖;流式细胞技术检测BMSCs周期的变化;免疫细胞化学染色、共聚焦扫描显微镜检测BMSCsPCNA 的表达。
    结果
    1、成功培养BMSCs,检测BMSCs的表面标记物CD44呈阳性表达,CD34呈阴性表达。
    2、在各组BMSCs形态呈梭形、纤维母细胞样。1%、3%PRP与PL条件培养基组BMSCs增殖速度明显快于普通培养基组,而3%PRP与PL组BMSC增殖速度快于1%PRP与PL组。
    3、MTT法检测细胞生长、增殖并做细胞生长曲线,即第1-2d,BMSCs增殖缓慢,数目均无明显变化,为细胞潜伏期;第3d,细胞增殖迅速,数量开始明显增加,进入对数生长期;6-7d细胞生长缓慢,为生长平台期。细胞生长曲线近似“S”形。统计学分析,1%、3%PRP与PL条件培养基组的BMSCs增殖速度均高于普通完全培养基组(P<0.05),1%PRP与PL和3%PRP与PL条件培养基组BMSCs增殖速度比较无明显差异(P>0.05)。
    4、流式细胞仪检测各组BMSCs的周期,第1d处于G1细胞比例较多,S期和G2期细胞比例较少。第3d、5dG1期细胞比例降低,G2、S期细胞比例升高。1d、3d、5d1%、3%PRP与PL条件培养基组G1期低于普通完全培养基组(P<0.05),S、G2期高于普通完全培养基组,(P<0.05)。1%PRP与PL和3%PRP与PL条件培养基组G1、S、G2期比较无统计学意义(P>0.05)
    5、PCNA 免疫细胞化学染色结果:1d、3d、5d,1%、3%PRP与PL条件培养基组PCNA 的表达明显高于普通完全培养基组(P<0.05)。1%PRP与PL和3%PRP与PL条件培养基组比较无统计学意义(P>0.05)。
    6.、激光扫描共聚焦显微镜下观察实验组BMSCsPCNA 表达的部位显示绿色荧光;1d、3d、5d,1%、3%PRP与PL条件培养基组PCNA 的表达明显高于普通完全培养基组(P<0.05),1%PRP及PL和3%PRP与PL条件培养基组比较无统计学意义(P>0.05)。与PCNA 免疫组化染色结果相符合。
    结论

    1、PRP和PL对BMSCs增殖有促进作用,两者在同浓度条件下效果相当。在体外培养条件下,不同浓度PRP和PL均对BMSCs细胞形态变化无明显影响。
    2、PRP和PL均可显著增加增殖期细胞数量,两者在同浓度条件下对生长曲线和BMSCs细胞周期变化无显著差别。
    3、PRP和PL均可显著增强BMSCs细胞PCNA 表达,两者在同浓度条件下无显著差别。