赖建明      林建华       林文平     吴朝阳

目的 构建猪TGF-β1 重组慢病毒表达载体，并转染BMSCs，为构建组织工程骨软骨提供TGF-β1 修饰的BMSCs，作为持续、高效的种子细胞。 方法 将已获取的目的基因TGF-β1 cDNA 包装至慢病毒载体中，通过PCR及基因测序对阳性克隆进行鉴定，并测定病毒滴度。取2 月龄巴马香猪（体重约15 kg）骨髓制备BMSCs，取第2 ～ 3代用于实验。用TGF-β1 重组慢病毒载体以感染复数（multiplicity of infection， MOI）为10、50、70、100、150 分别转染BMSCs，通过激光共聚焦显微镜观察，并以Western blot 检测不同MOI 值的转染效果，确定最佳MOI 值。用TGF-β1 重组慢病毒载体以最佳MOI 值感染BMSCs 作为实验组，以空载体转染的BMSCs（空载体组）及未转染的BMSCs（空白组）作为对照，通过RT-PCR、免疫细胞化学染色、ELISA 等方法检测TGF-β1 基因及蛋白在BMSCs 中的表达情况，并检测Ⅱ型胶原表达情况。 结果 经PCR 及基因测序鉴定TGF-β1 重组慢病毒表达载体构建成功，并成功转染BMSCs，激光共聚焦显微镜下可观察到强绿色荧光；Western blot 示MOI 为70 时转染效果最佳；RT-PCR 示实验组TGF-β1 基因的表达量明显高于空载体组及空白组，差异有统计学意义（P < 0.05）；免疫细胞化学染色示实验组TGF-β1 蛋白及Ⅱ型胶原呈阳性表达，而空载体组及空白组呈弱阳性或阴性表达；ELISA 示实验组TGF-β1 蛋白至转染后21 d 仍有较高表达。 结论 TGF-β1 重组慢病毒表达载体可成功转染BMSCs，TGF-β1 蛋白可长期、稳定表达，促使BMSCs 向成软骨细胞方向分化。